Sclerosis lateralis amyotrophica (ALS)

Korábbi írásaimban SMA-val kapcsolatos munkákat mutattam be. Azonban vannak más motoneuronokat érintő betegségek is. Ilyen például a Sclerosis lateralis amyotrophica (ALS).
Az ALS a motoneuronok pusztulásával járó neurodegeneratív megbetegedés, amely a test izmainak gyengeségéhez, sorvadásához (amyotrophia) és néhány éven belül halálhoz vezet.  A motoneuronok mellett a motoros kéreg piramissejtjei is érintettek lehetnek a betegségben. Ez vezet a lateralis funiculus sorvadásához (sclerosis lateralis).  A betegségnek 2 formája ismert: sporadikus, diffúz etiológiájú (90-95%) és familiáris (5-10%). A familiáris esetek többségében igazolható a réz-cink superoxid dismutase (SOD1) mutáció. A SOD1-hiány a familiáris ALS-ek 20%-áért felelős, ezért más génhibák is szerepet játszhatnak a betegség kialakulásában. Azonban az ALS esetek túlnyomó részében az ok ismeretlen.
A Sod1 mutáns transgenikus egerek létrehozásával új lehetőségek nyíltak a betegség lefolyásának vizsgálatára. Az eddig elvégzett kísérletek megingatták a hagyományos betegséglefolyás képét ALS-ben.  A hagyományos elképzelés szerint először a sejttest degenerálódik, majd ezt követi az axon és a véglemez károsodása.  A Sod1G93A mutáns egérben a tünetek megjelenése előtt beindult a véglemezek denervációja, majd a tünetek megjelenésével párhuzamosan degenerálódtak az axonok és végül kiterjedt motoneuron pusztulás következett be.  Bár a motoneuron különböző részeinek megmentésére tett kísérletek eredményei rendkívül biztatóak, a korai véglemez károsodás mechanizmusait a SOD1 modellben nem sikerült tisztázni.

Excitotoxicitás

A glutamaterg neuronok kulcsfontosságú szerepet játszanak számos neurophysiologiai folyamatban. Normál körülmények között serkentő választ generál kölcsönhatva a posztszinaptikus glutamát receptorokkal. Azonban a glutamát receptorok folyamatos aktivációja neuronális diszfunkciót eredményezhet, amely a sejt halálához vezethet. Ezt a folyamatot nevezzük excitotoxicitásnak, mely a neurodegeneratív betegségek (ALS, SMA) során az egyik kiváltó oka a neuronok pusztulásának.

A serkentő hatású glutamát különböző receptorokon fejtheti ki hatását. Ezek lehetnek ionotróp receptorok és metabotrop receptorok. Az ionotróp receptorok közé tartozik az N - metil-D - aszparaginsav ( NMDA) , α - amino -3 -hidroxi -5- metil-izoxazol -4 - propionát ( AMPA) és kainsav (KA ) receptorok. Ezek az ionotróp receptorok ligand-vezérelt ion csatornák. A metabotróp receptorok G fehérje kapcsoltak.

Mi történik az excitotoxicitás során? A következőekben csak az NMDA és AMPA receptorokhoz köthető folyamatokról írok. A felszabaduló glutamát kapcsolódik az NMDA és AMPA receptorokhoz, melynek eredménye, hogy Ca2+ és Na+ áramlanak a sejtbe. Normál körülmények között a felszabadult glutamátot főleg az asztrocitákon található EAAT2/GLT1 glutamát transzporterek eltávolítják a szinaptikus résből. Kóros esetekben a glutamát nem kerül eltávolításra a szinaptikus résből és folyamatosan aktiválja az NMDA és AMPA receptorokat. Ennek eredménye, hogy a Ca2+ és Na+ folyamatosan áramlanak be a sejtbe, ezzel depolarizálva azt. A Ca2+ és Na+ koncentráció egy idő után olyan szintet ér el a citoplazmában, hogy megnyílnak a feszültségfüggő Ca2+ csatornák és további Ca2+ áramlanak az extracelluláris térből a citoplazmába. A nagy koncentrációban jelenlévő Ca2+ iont nem tudja a sejt megkötni, ezért olyan szignalizációs útvonalak aktiválódnak, amelyek beindítják az apoptózist. A sejt folyamatos tüzelése és az aktivált apoptotikus útvonal végül a sejt pusztulásához vezet.

Asztrociták negatív szerepe SMA egerekben

Számos tanulmány fókuszál arra, hogy az SMA következtében elpusztuló neuronokat megmentsék azáltal, hogy megpróbálják az érintett neuronokban emelni az SMN fehérje szintjét. Ugyanakkor jóval kevesebb kísérlet foglalkozik az asztrocitákat szerepével.

Az asztrociták fontos szerepet töltenek be a központi idegrendszer megfelelő működésében. Normál körülmények között fenntartják környezetükben a megfelelő homeosztázist, szabályozzák a növekedési faktorok szekrécióját és az extraszinaptikus glutamát mennyiségét, illetve szerepet játszanak a vér-agy gát felépítésében is. Neurodegeneratív betegségek vagy a központi idegrendszer sérülését követően az előbb említett folyamatok felborulnak, az asztociták reaktívvá válnak és proinflammatorikus fehérjéket kezdenek el expresszálni, valamint hozzájárulnak a szinaptikus résben megnövekedett glutamát mennyiségéhez, amely excitotoxicitást okoz. Ezek a folyamatok végül a neuronok pusztulásához vezetnek.

Jered V. Mccivern és kollégái idén megjelent cikkükben az asztrociták negatív szerepét mutatták be SMA egér modellben. Három napos SMA egerek asztrocitáit megemelkedett GFAP szint, vastag rövid nyúlványok és megduzzadt sejttest jellemezte. Ugyanakkor 3 napos egészséges kontroll állatokban gyenge GFAP kifejeződés és vékony, hosszú nyúlványok jellemezték az asztrocitákat.

SMA és egészséges állatok szomatikus sejtjeiből iPS sejteket hoztak létre, majd ezeket az iPS sejteket asztrocitákká differenciáltatták, hogy in vitro tanulmányozzák őket. Négy héttel a differenciáció után az SMA iPS asztrocitákban megemelkedett a GFAP szintje, míg kontroll iPS asztrocitákban ez nem volt megfigyelhető.

A fentiekben ismertetett eredmények az asztrociták morfológiai és fenotípus eltéréseire mutattak rá. Azonban az intrarcelluláris Ca szintben is mutatkoztak különbségek in vitro. Az SMA iPS asztrocitáknak az alap Ca szintje magasabb volt, mint a kontroll csoport asztrocitáinak. Az SMA iPS asztrociták Ca szintje, akkor érte a kontroll asztrociták intracelluláris Ca szintjét, ha az extracelluláris Ca-t eltávolították a tenyészetből. Továbbá normál körülmények között ATP-vel történő stimulálásra az intracelluláris Ca szint emelkedésével válaszoltak a kontroll asztrociták, ellentétben az SMA iPS asztocitákkal, amelyeknek intracelluláris Ca szintje nem változott.

Ezek az eredmények arra engedik következtetni a kutatókat, hogy az asztrociták korai diszfunkciója is hozzájárul a motoneuoronok pusztulásához.

Transzplantált neurális őssejtek hatása egér SMA modellben

Ebben a bejegyzésben Corti és kollégáinak munkáját ismertetem röviden.  Kísérleteikben olyan egereket használtak, amelyek SMA-ban szenvedtek. Ezek az egerek csupán 16 napig élnek túl születésüktől számítva, köszönhetően az SMA-nak.

A kísérletekben azt vizsgálták, vajon egészséges egér embrió gerincvelőből izolált neurális őssejtek intrathecális transzplantációjával késleltethető-e a motoneuronok pusztulása SMA egerekben.

Az őssejteket egy nappal az egerek megszületését követően transzplantálták. A transzplantált sejtek képesek voltak bevándorolni a gerincvelőbe és  motoneuronhoz hasonló tulajdonságokkal bíró neuronokká differenciálódni. Továbbá az őssejtkezelésen átesett SMA egerek motoneuronjai nem pusztultak olyan mértékben, mint a kezeletlen SMA egerek motoneuronjai. Az őssejt transzplantációnak más pozitív hatása is volt. A motoros egységek integritása és a motoros funkció is hosszabb ideig fennmaradt, mint azokban az SMA egerekben, amelyek nem kaptak őssejteket. A kezelt egerek életideje is megnövekedett. A transzplantált csoportba tartozó egerek életideje 25%-kal (21 napra) emelkedett.

A kapott eredmények alapján elmondható, hogy a transzplantált sejtek korlátozott ideig, de képesek neuroprotektív hatást gyakorolni a motoneuronokra és késleltetni azok pusztulását.

Forrás: Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J. Clin. Invest. 118:3316–3330 (2008). doi:10.1172/JCI35432.

 

A Repligen cég engedélyt kapott az RG3039 elnevezésű gyógyszerjelölt molekula klinikai fázis 1b kísérletben történő kipróbálására

Az RG3039 az első olyan gyógyszerjelölt molekula, amelyet kifejezetten SMA betegek gyógyítására fejlesztenek. Állatkísérletekben már bizonyították, hogy az RG3039 késleltette a motoneuronok pusztulását, megnövelte az SMA állatmodellekben az állatok élettartamát, illetve SMA páciensekből származó sejtekben emelte az SMN fehérje mennyiségét.

Ezt követően indultak el a klinikai fázis 1a kísérletek, melyek pozitív eredményeinek köszönhetően vált lehetővé, hogy az egyesült államokbeli Repligen cég engedélyt kapjon a klinikai fázis 1b kísérlet (toxicitási kísérlet) elindításához. A kísérlet során két csoportot állítottak fel, amelyeket egészséges önkéntesek alkottak. Az egyik csoport RG3039-et, míg a másik csoport placebot kapott.

A klinikai fázis 1b kísérletet a Families of SMA nonprofit szervezet támogatta. A szervezet 85.000 taggal és támogatóval rendelkezik, a szervezet célja, hogy az alapkutatásban felfedezett gyógyszerjelölt molekulák később klinikai kipróbálásra kerülhessenek.

A cégről bővebben a www.repligen.com, a nonprofit szervezetről www.fsma.org honlapon lehet olvasni.

Gyógyszerjelölt molekula az SMA ellen

A Neurológiai Rendellenességek és Sztrók Nemzeti Intézete (NINDS) által elindított tanulmányban bemutattak egy gyógyszerjelölt molekulát, mely emeli az SMN fehérje szintjét SMA-ban szenvedő egerekben.

Az FDA által is jóváhagyott Indoprofen hatását vizsgálták SMA modellekben. Kimutatták, hogy az Indoprofen jelentősen növeli az SMN expressziót olyan fibroblasztokban, amelyek SMA betegekből származtak. Továbbá igazolták, hogy az SMN fehérje expressziós szintje emelkedett Indoprofen kezelés hatására súlyos SMA-ban szenvedő egereknél.

Az elindított tanulmány során 5 év alatt több, mint 1400 Indoprofen analóg molekulát vizsgáltak meg. Ezek közül 150-et válsztottak ki további jellemzésre.

Egy analóg molekula (ALB-111) került végül kiválasztásra, mint potenciális gyógyszerjelölt molekula. Ezt a molekulát tesztelni kezdték és kimutatták, hogy emeli az SMN fehérje szintjét és vizsonylag könnyen bejut a központi idegrendszerbe.

A tanulmányban részt vevő PsychoGenics kutatói különböző teszteket végeztek el SMA-ban szenvedő egereken és a következő eredményeket kapták. Az SMA egerek hátsó végtagja által kifejtett izomerő jobb volt az ALB-111-el kezelt csoportban, mint a kezeletlen SMA csoportban. Ugyanakkor a kezelt csoportban lévő egerek nem éltek tovább, mint kezeletlen társaik.

Mivel az ALB-111 megfelelő biztonsági paraméterekkel rendelkezik, ezért a későbbiekben megvalósítható lenne szájon át történő alkalmazása és preklinikai gyógyszerfejlesztése is.

-->

Antiszensz oligonukleotidokkal az SMA betegség ellen

A spinalis muscularis atrophia egy autoszómális recesszív módon öröklődő betegség. A betegség kifejlődése során a gerincvelő mellső szarvában található mozgató idegsejtek (motoneuronok) elpusztulnak, amely a végtag- és törzsizmok atrophiáját eredményezi. Frank Bennett, az Isis Pharmaceuticals cég egyik vezető kutatója 8 éves kitartó kutatómunkával jutott el oda, hogy az FDA engedélyezze az antiszensz oligonukleotidok kipróbálását humán kísérletekben. Munkáját szoros együttműködésben végezte akadémiai kutatócsoportokkal.

Az SMA genetikai háttere

Az SMA betegség oka, hogy az SMN1 génen olyan mutáció következik be, amely megakadályozza, hogy a génről funkcióképes SMN fehérje képződjön. Azonban a humán genomban található egy az SMN1 génnel majdnem teljesen megegyező gén, az SMN2. Az eltérés a 2 gén között csupán 11 nukleotid. Az egyik ilyen nukleotid eltérés a 7. exonon található, ahol az egyik citozin helyett timin van. Ez az egy nukleotid eltérés okozza azt, hogy az SMN2 gén 7. exonja nem kerül bele az érett RNS-be. Ennek hiányában azonban működőképes fehérje nem készülhet, csak az esetek kis százalékában, amely azonban nem tudja kompenzálni az SMN1 génről készülő funkcióképes fehérjék hiányát. Azonban az antiszensz oligonukleotidok alkalmazása lehetővé teszi, hogy az SMN2 gén 7. exonja is belekerüljön az érett mRNS-be és így működőképes fehérje készüljön.

Antiszensz oligonukleotidok

Az antiszensz oligonukleotidok képesek RNS-ekhez kötődni, így megakadályozhatják az adott RNS lebomlását, különböző fehérjék kötődését. Az antiszensz oligonukleotidokon különböző kémiai módosításokat lehet elvégezni, melynek következtében ellenállóvá és stabillá válnak a különböző bontóenzimek (nukleázok) ellen. A bontóenzimek elbontják azokat az RNS-eket vagy akár az antiszensz oligonukleotidokat is, amelyekhez hozzáférnek.

Normál körülmények között nem képesek átjutni a vér-agy gáton, ezért az állatkísérletek során a agy-gerincvelői folyadékba fecskendezve alkalmazzák őket. A befecskendezést követően az antiszensz oligonukleotidokat a központi idegrendszerben található neuronok, asztrociták, és mikroglia sejtek képesek felvenni.

Antiszensz oligonukleotidok az SMA ellen

Miután sikerült bizonyítani, hogy az antiszensz oligonukleotidokat képesek felvenni a központi idegrendszer sejtjei, elkezdődőtt olyan antiszensz oligonukleotidok kifejlesztése, amellyel el lehet érni, hogy az SMN2 génről több funkcióképes fehérje készüljön. A módosítások hatására sikerült elérni, hogy az SMA-ban szenvedő egerek SMN2 génről készülő érett RNS-ébe a 7. exon is belekerüljön (1. kép). Az ezt követő vizsgálatok pedig bizonyították, hogy az antiszensz oligonukleotid kezelés késleltette a motoneuronok pusztulását és növelte az egerek túlélési idejét.

1. kép Antiszensz oligonukleotid hatásmechanizmusa

Ha a hnRNP elnevezésű fehérje köt a pre-mRNS-hez, akkor a 7. exon (piros) nem tud belekerülni az érett mRNS-be és nem készül működőképes fehérje. Ha az antiszensz oligonukleotid kötődik az SMN2 génről készült pre-mRNS-hez, akkor a kötődéssel megakadályozza, hogy a hnRNP fehérje kapcsolódjon a pre-mRNS-hez. Ezáltal a 7. exon bele tud kerülni az érett mRNS-be, így megnő az esélye, hogy működőképes fehérje készüljön az SMN2 génről. Az ábra az alábbi forráson alapul: Rigo F. et al. J. Cell Biol. 2012, 199:21-25.

Humán klinika kísérletek

Az FDA engedélyt adott, hogy humán klinikai kísérletek is elinduljanak. Jelenleg az I. fázisban tart az antiszensz oligonukleotidok kipróbálása. A kísérlet ISIS SMN_Rx néven fut.

Pajer Krisztián